ANALISIS KUANTITATIF ANDROGRAFOLID DALAM EKSTRAK SAMBILOTO (Andrographis paniculata Ness) SECARA KLTKT-DENSITOMETRI
Awal P, Mujahid R, Yuli W.
Balai Besar Litbang Tanaman Obat dan Obat Tradisional
Badan Litbang Kesehatan
Kem Kes RI
ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian penetapan kadar
andrografolide dalam ekstrak sambiloto (Andrographis
paniculata Ness). Penelitan ini bertujuan untuk mengetahui kadar
andrografolide dalam ekstrak sambiloto dengan menggunakan metode
KLTKT-Densitometri.
Proses ekstraksi dilakukan menggunakan etanol 90%.
Ekstrak etanol dan baku senyawa andrografolide ditotolkan pada plat KLTKT
Silika gel-F254, dengan menggunakan Linomat 5, kemudian dieluasikan
dalam chamber yang berisi campuran CHCl3: MeOH (9:1), sebagai fase
geraknya. Setelah proses eluasi, plat kemudian dikeringkan. Deteksi noda serta
kuantifikasi dilakukan dengan Densitometer Scanner Camag- Wincat 4.
Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa panjang
gelombang serapan maksimal antara noda ekstrak dan larutan baku adalah sama,
yaitu pada panjang gelombang 230 nm. Kadar andrografolide pada ekstrak adalah
15,54 + 0,16 % b/b dengan KV 1,01%.
Kata
kunci: Ekstrak sambiloto, KLTKT-Densitometri, adrografolid
PENDAHULUAN
Sambiloto merupakan salah satu bahan penyusun ramuan
jamu antidiabetes, dan dibuat sediaan bersama-sama simplisia yang lain dalam
bentuk serbuk simplisia, pil, kapsul ataupun kaplet (Anonim, 2008). Sambiloto memiliki rasa yang sangat pahit.
Rasa pahit ini disebabkan oleh senyawa
andrografolid (Arshia dkk., 2007). Rasa pahit sambiloto 2,8 kali rasa pahit
dari kuinin HCl (Ameh dkk., 2007).
Andrografolid merupakan senyawa
aktif utama dalam sambiloto, dan berkhasiat sebagai antidiabetes (Subramanian
dkk., 2008). Andrografolid ditemukan
pada bagian akar (Kardono dkk., 2003), batang dan daun (Farnsworth &
Bunyapraphatsara, 1992) serta herba (Kulyal dkk., 2010). Andrografolid merupakan kristal tidak
berwarna larut dalam metanol, etanol, aseton, piridine, etil asetat, kloroform
dan asam asetat, namun sedikit larut dalam air dan tidak larut dalam dietil
eter (Qiang, 2007).
Uji kualitatif andrografolid dalam ekstrak dilakukan
dengan jalan melarutkan andrografolid ataupun ekstrak dalam etil asetat (Chao
& Lin, 2010). Hal ini dilakukan karena etil asetat mampu
melarutkan andrografolid, namun tidak melarutkan klorofil yang masih
tersisa dalam ekstrak, sehingga dapat meminimalisir kemungkinan terganggunya
pengamatan karena adanya klorofil. Uji kualitatif selanjutnya dilakukan dengan
jalan membandingkan nilai Rf kromatogram dari andrografolid baku dan ekstrak,
serta mengamati panjang gelombang maksimumnya.
Uji kuantitatif andrografolid dapat dilakukan secara
titrimetri, spektrofotometri, HPLC maupun KLTKT (Mamatha, 2011). Namun metode
penetapan kadar andrografolid secara spektrofotometri, memiliki kelemahan yaitu
pada saat penambahan KOH etanolat pada larutan andrografolid akan terbentuk
warna merah, tetapi warna merah tersebut tidak stabil, cepat memudar (Maiti dkk.,
1959). Pada penetapan kadar andrografolid secara HPLC memakan waktu relative
lama, serta memerlukan banyak tahap ekstraksi dan purifikasi (Saxena, dkk., 1998;
Sharma, dkk., 1992). KLTKT merupakan
salah satu metode penetapan kadar yang
cukup luas digunakan dengan hasil yang cukup memuaskan. Metode ini sederhana,
mudah dilakukan, cukup teliti dan sensitive, serta dapat diterapkan untuk
ekstrak kasar (Bhutani, 2000; Srivasta dkk., 2004), sehingga dapat diterapkan
untuk penetapan kadar andrografolid dalam ekstrak. KLTKT dimaksudkan untuk
mendapatkan pemisahan dan hasil analisis yang lebih baik dibandingkan KLT
biasa. Fase diam pada KLTKT memiliki
ukuran pori-pori yang sangat halus, serta seragam dengan ketebalan 0,1 mm.
Ukuran partikel fase diam yang lebih kecil ini menyebabkan semakin banyak
jumlah lempeng pemisah, sehingga pemisahan menjadi lebih efisien (Gandjar &
Rohman, 2008). Pada analisis kuantitatif, bercak pada fase diam dapat langsung
diukur menggunakan ukuran luas atau dengan teknik densitometri. Densitometri
dapat bekerja secara serapan atau fluoresensi. Sistem fluoresensi biasanya
lebih disukai karena kelinieran respon dan selektifitasnya lebih tinggi serta
gangguan fluktuasi latar belakang lebih rendah (Gandjar dan Rohman, 2008). Bercak yang diukur dengan system fluoresensi,
serapan ultraviolet atau sinar tampak dapat ditetapkan lebih teliti daripada
bercak yang disemprot dengan pereaksi warna (Gandjar dan Rohman, 2008).
METODOLOGI
Bahan dan
Alat Penelitian
Penelitian dilakukan di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman
Obat dan Obat Tradisional, Tawangmangu-Jawa Tengah, dari bulan Juni 2010 hingga
November 2010. Baku andrografolid (Sigma-Aldrich), Plat Silikagel F254
KLTKT, 20x5, aluminium sheet (E-Merck),
CHCL3 (E-Merck), Metanol (E-Merck), Etil asetat (E-Merck),
KLT-Densitometri, Wincat 4, Linomat 5.
Jalannya Penelitian
1. Penyiapan larutan baku andrografolid.
Larutan baku dibuat dengan melarutkan 2,1 mg andrografolid dalam 50 ml etil
asetat, sehingga larutan baku andrografolid memiliki konsentrasi 0,042 µg/µL.
2. Penyiapan fase diam dan fase gerak.
Fase diam menggunakan plat KLTKT Silikagel F254, aluminium sheet
20x5. Fase gerak menggunakan campuran CHCL3:MeOH (9:1). Penjenuhan
chamber dilakukan selama 20 menit, jarak eluasi 3,5 cm, deteksi kromatogram
dilakukan pada 230 mn.
3. Uji Kualitatif andrografolid dalam Ekstrak Sambiloto.
Uji kualitatif
andrografolid dalam ekstrak dilakukan dengan jalan melarutkan andrografolid
ataupun ekstrak dalam etil asetat, ditotolkan pada plat KLTKT, dieluasikan pada
fase gerak, diamati harga Rf kromatogram, dibandingkan dengan standar.
4. Pembuatan kurva linearitas.
Ditimbang seksama 2,1 mg baku andrografolid, dilarutkan
dalam 50 ml etil asetat. Larutan baku andrografolid dalam etil asetat (larutan
1) ditotolkan pada Plat KLTKT ukuran 5 x 20 cm, menggunakan Linomat-5.
Penotolan larutan standart sebanyak 5, 10,15,20,25,30 dan 35 µL, dan
dieluasikan dalam fase gerak CHCl3:MeOH (9:1). Jarak eluasi 3,5 cm.
Deteksi dilakukan pada λ 230 nm (Aulia, 2008). Dibuat grafik konsentrasi
vs luas area. Data yang ada kemudian dimasukkan dalam persamaan regresi hingga
diperoleh nilai slope (b), intersep (a) dan koefisien korelasi (r). Sebagai
parameter adanya hubungan linier, digunakan koefisien korelasi (r) pada
analisis regresi linier Y= a + bx. Hubungan linier ideal dicapai jika a = 0 dan
r = +1 atau r = -1, bergantung pada arah garis persamaan. Rentang konsentrasi
sampel menunjukkan batas terendah dan tertinggi analit yang dapat ditetapkan
dengan ketepatan, ketelitian dan linearitas yang dapat diterima.
5. Penentuan Akurasi dan Presisi Abdrographolide.
Uji akurasi dilakukan dengan menghitung perolehan kembali analit dalam
rentang konsentrasi 80-120% (Harmita, 2004).
Uji presisi dilakukan dengan menghitung nilai standar baku relatif atau
koefisien variasi (KV). Syarat akseptabilitas akurasi dan presisi adalah nilai
perolehan kembali 98-102% dan KV= 2% (Nash & Wachter, 2003; Harmita, 2004).
Perolehan kembali baku andrografolid dalam etil asetat setelah diekstraksi
dengan dapar asetat pH 4,5, menunjukkan efisiensi proses ekstraksi yang
dilakukan. Semakin tinggi prosen perolehan kembali, semakin efektif proses
ekstraksi. Ditimbang baku andrografolid dengan konsentrasi 80-120%, dilarutkan
dalam 50 ml etil asetat (larutan 1). Dipipet
1 ml larutan 1, dimasukkan dalam labu takar 5 ml, ditambah dengan 1,5 ml etil
asetat, ditambah larutan dapar asetat pH 4,5, divorteks selama 3 menit,
kemudian didiamkan hingga kedua lapisan memisah. Dipipet fraksi etil asetat, kemudian ditotolkan pada plat KLTKT
silikagel GF254, sebanyak 15 µL.
Dihitung perolehan kembali andrografolid.
6. Penetapan Kadar Andrografolid dalam ekstrak sambiloto.
Ditimbang ekstrak sambiloto + 80,0 mg. Ekstrak dimasukkan dalam labu
takar 200 ml, ditambah dengan 1 ml SLS 0,1, ditambah dengan dapar asetat hingga
garis tanda (larutan 1), dihomogenkan. Dipipet 2,5 ml larutan 1, dimasukkan
dalam labu takar 5 ml, ditambah dengan 2,5 ml etil asetat, divorteks selama 3
menit, kemudian didiamkan hingga kedua lapisan memisah. Dipipet fraksi etil asetat, kemudian ditotolkan pada plat KLTKT
silikagel GF254, Dihitung perolehan kembali andrografolid .
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
Hasil analisa kualitatif
andrografolid dalam ekstrak sambiloto ditampilkan pada gambar 1 sebagai berikut: S1 S2 E1
E2
Andrografolid
Gambar 1. Profil Kromatogram Baku andrografolid (S) dan ekstrak
sambiloto (E), diamati pada UV254 nm
Pada gambar 1 terlihat
bahwa pengamatan KLTKT dibawah sinar UV254 nm, menunjukkan adanya
pemadaman noda. Hal ini terjadi, karena
adanya senyawa seng silikat yang ditambahkan pada fase diam KLTKT. Seng silikat
ini akan berfluoresensi saat terpapar sinar UV 254 nm (Gandjar & Rohman,
2008). Sedangkan senyawa yang ditotolkan
di atas plat, akan menghalangi masuknya sinar UV menembus plat, sehingga akan
tampil sebagai bercak-bercak berwarna gelap, dengan latar belakang pendar hijau
muda dari cahaya UV254 nm (Sherma & Fried, 2003). Hasil pengamatan spectrum panjang gelombang
maksimal antara baku andrografolid dan ekstrak sambiloto, ditampilkan pada
Gambar 2.
Keterangan: S1
& S2 = Standar andrografolid E1
& E2 = Ekstrak sambiloto E1 E2 S1 S2
Gambar 2.
Spektrum baku Andrografolid dan ekstrak sambiloto pada 230 nm
Dari gambar 2 terlihat bahwa panjang gelombang maksimal
baku andrografolid dan ekstrak sambiloto berimpit pada panjang gelombang 230
nm. Adapun hasil pencatatan Rf
kromatogram ditampilkan pada
Gambar 3.
4 Rf = 0,82
3 Rf = 0,51
2 Rf = 0,38 (Andrografolid)
1 Rf = 0,11
Gambar 3. Nilai Rf baku Andrografolid dan ekstrak
sambiloto.
Berdasarkan data scanning
panjang gelombang larutan baku andrografolid dan ekstrak sambiloto yang
berhimpit pada λ 230 nm, serta harga Rf spot yang sama antara baku
andrografolid dan ekstrak sambiloto pada nilai Rf = 0,38, maka dapat
disimpulkan bahwa ekstrak sambiloto positif mengandung senyawa andrografolid.
Hubungan linier antara konsentrasi andrografolid baku
dengan luas area ditentukan dengan membuat seri pengenceran baku andrografolid
hingga diperoleh rentang konsentrasi 0,2058 µg/µL sampai 1, 4406 µg/µL. Hasil
yang diperoleh berupa konsentrasi vs
luas area dan selanjutnya dibuat persamaan garis regresi linier serta
ditentukan koefisien korelasinya. Dengan nilai koefisien korelasi tersebut,
dapat ditentukan, apakah linearitasnya memenuhi syarat atau tidak, yang
didasarkan pada nilai r hitung hasil regresi dibandingkan dengan r tabel pada taraf kepercayaan dan derajat bebas
tertentu. Jika r hitung lebih besar dari r tabel pada p dan db tertentu, maka
dikatakan bahwa linearitasnya baik dan dapat digunakan untuk perhitungan
selanjutnya (Miller & Miller, 1988).
Hasil terlihat pada Tabel I.
Tabel I. Hasil
uji linearitas metode densitometri berdasarkan luas area untuk pembuatan kurva
baku Andrografolid (0,258-1,4406 µg/µL), setelah dieluasikan dengan CHCl3:MeOH
(9:1)
|
C
andrografolid (µg) |
Luas
Area |
Luas
area/10000 |
Persamaan
Regresi |
|
0,2058 |
1653 |
0,1653 |
Y = 0,4195X + 0,1194 r
= 0,9901 |
|
0,4116 |
3009 |
0,3009 |
|
|
0,6174 |
4055 |
0,4055 |
|
|
0,8232 |
4881 |
0,4881 |
|
|
1,0290 |
5568 |
0,5568 |
|
|
1,2348 |
6461 |
0,6461 |
|
|
1,4406 |
6906 |
0,6906 |
Persamaan garis
regresi (konsentrasi vs luas area) Y =
0,4195X + 0,1194 menunjukkan korelasi yang baik, dilihat dari nilai r hitung
lebih besar dari r tabel pada p = 0,05, db = n-2 = 5 yaitu r = 0,754 (Muhidin
& Abdurahman, 2007).
Tabel II. Hasil uji akurasi dan presisi
baku Andrografolid
|
Konsentrasi |
Replikasi |
Luas Area teoritis/10000 |
Kadar tesoritis (µg) |
Kadar pengamatan (µg) |
Perolehan kembali (%) |
KV (%) |
|
80% |
1 |
0,3305 |
1666 |
1677,15 |
100,67 |
1,07 |
|
2 |
0,3288 |
1666 |
1663,93 |
99,98 |
||
|
3 |
0,3333 |
1666 |
1699,44 |
102,01 |
||
|
Rata-rata +
SD = 100,85 +1,08 |
||||||
|
100% |
1 |
0,3832 |
2058 |
2095,98 |
101,01 |
1,38 |
|
2 |
0,3837 |
2058 |
2100,11 |
102,05 |
||
|
3 |
0,3772 |
2058 |
2048,50 |
99,54 |
||
|
Rata-rata + SD = 101,14+1,39 |
||||||
|
120% |
1 |
0,4281 |
2450 |
2452,78 |
100,11 |
0,95 |
|
2 |
0,4244 |
2450 |
2423,61 |
98,92 |
||
|
3 |
0,4302 |
2450 |
2469,80 |
100,81 |
||
|
Rata-rata + SD
= 99,95+0,95 |
||||||
Hasil akurasi & presisi dapat dilihat pada Tabel
II. Uji akurasi (ketepatan) dalam penelitian ini digunakan untuk mengetahui
efektifitas proses ekstraksi yang dilakukan. Baku andrografolid konsentrasi
80-120%, dilarutkan dalam etil asetat, kemudian ditambah dengan dapar asetat pH
4,5 divorteks 3 menit., didiamkan hingga terpisah 2 lapisan Selanjutnya lapisan etil asetat ditetapkan kadarnya.
Jika etil asetat tidak mampu melarutkan andrografolid, maka kedekatan nilai
analisis kadar andrografolid dalam etil asetat setelah proses ekstraksi akan
berbeda jauh dengan kadar andrografolid dalam etil asetat sebelum proses
ekstraksi. Namun, jika nilai perolehan kembali andrografolid mendekati nilai
sebenarnya, maka proses ekstraksi berjalan efektif.
Berdasarkan
Tabel II dapat dilihat bahwa prosen perolehan kembali dari proses
ekstraksi pada rentang 98,92 -102,05% dengan nilai KV berkisar pada rentang
0,95-1,07% masuk dalam rentang penerimaan data akurasi dan presisi, yaitu untuk
konsentrasi analit >10%, nilai perolehan kembali 98-102%, nilai KV= 2% (Nash
& Watcher, 2003; Harmita, 2004). Nilai perolehan kembali yang relatif
tinggi ini, menunjukkan bahwa proses ekstraksi yang dilakukan berjalan efektif.
Pada penetapan kadar
andrografolid dalam ekstrak, dilakukan 9 replikasi, untuk memastikan nilai presisinya.
Profil kromatogram pada sinar UV 366 dan UV 254 dapat dilihat pada Gambar 4,
sedangkan profil kromatogram hasil
scanning menggunakan densitometri ditampilkan pada Gambar 5.
Gambar 4.
Profil kromatogram baku andrografolid dan ekstrak pada λ 254 nm dan 366 nm
Gambar 5.
Profil kromatogram baku andrografolid dan ekstrak berdasarkan densitometry
Dari hasil pengamatan diatas
diperoleh persamaan regresi sbb: Y = 0,3794X + 0,1318 , dengan nilai r =
0,9830, menunjukkan korelasi yang baik, dilihat dari nilai r hitung lebih besar
dari r tabel pada p = 0,05, db = n-2 = 5 yaitu r = 0,754 (Muhidin &
Abdurahman, 2007), sedangkan hasil penetapan kadarnya ditampilkan pada Tabel 3.
Tabel III.
Hasil penetapan kadar Andrografolid dalam ekstrak sambiloto
|
Replikasi |
Bobot ekstrak
(µg) |
Luas
area/10000 |
Kadar (%) |
Rata-rata (%) |
|
KV (%) |
|
1 |
80200 |
0,4613 |
15,47 |
15,54 |
|
1,01 |
|
2 |
80100 |
0,4626 |
15,55 |
|||
|
3 |
80100 |
0,4605 |
15,45 |
|||
|
4 |
80000 |
0,4562 |
15,27 |
|||
|
5 |
79000 |
0,4625 |
15,76 |
|||
|
6 |
80100 |
0,4631 |
15,57 |
|||
|
7 |
80200 |
0,4608 |
15,45 |
|||
|
8 |
79000 |
0,4621 |
15,74 |
|||
|
9 |
80000 |
0,4640 |
15,64 |
Berdasarkan Tabel III, terlihat bahwa kadar
andrografolid dalam sampel memiliki nilai presisi yang tinggi, ditunjukkan
dengan nilai KV < 2%, yang berarti bahwa sebaran data hasil analisis tidak
saling berjauhan.
KESIMPULAN
Hasil penelitan yang
diperoleh menunjukkan bahwa nilai Rf noda ekstrak dan larutan baku
adalah sama yaitu 0,38, dengan panjang
gelombang serapan maksimal adalah 230
nm, serta kadar andrografolid pada
ekstrak adalah 15,54 + 0,16 % b/b dengan KV 1,01%.
DAFTAR PUSTAKA
Ameh., Sunday., Obodozie., Obiageri.,
Inyang., Uford., Abubakar., Mujibata., Garba.,
Makaji., 2007, A Normative Study of Nigerian Grown “Maha Tita” (King of Bitters) Andrographis paniculata Nees, Int.J.Drug Dev.&Res. Vol 2(2): 291-299.
Anonim,
2008, Daftar Obat Alam (DOA) Ed.3,
hal:43-45, Semarang
Arshia, S., Manna,P.K., Paranjothy,
K.L.K, Manjula, M, 2007, Entrapment of Andrografolid
in Cross-Linked Alginate Pellet: 1. Formulation and evaluation of Associates Release Kinetic, Pak.J.Pharm. Sci, Vol 291): 1-9
Aulia, N., 2008, Penetapan Kadar
Andrografolida dan Kurkumin dalam Ekstrak campuran
Herba Sambiloto dan Rimpang Kunyit dengan Metode KLT- Densitometri, Skripsi, Unair (ABSTRAK), http://210.57.222.58/go.php?id=gdlhub-gdl-S1-2008-nuraniaulia-9207 , disitasi: November 2009.
Bhutani
KK. 2000. Fingerprintings of Ayurvedic drugs. Eastern Pharmacist;5:21-24.
Chao, W,W
and Lin, B,F, 2010, Isolation and Identification of Bioactive compounds in Andrographis paniculata (Chuanxinlian), Chin Med, Vo.13, 5:17.
Farnsworth,
N, R, and Bunyapraphatsara, 1992, Thai Medicinal Plants, hal 57-62, Prachachon
Co. Ltd.
Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2008, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta, 353-377.
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan
Validasi Metode and Cara Perhitungannya, Majalah
Ilmu Farmasi, Vol 1(3): 117-135
Kardono,L,B,S., Artanti,N., Dewiyanti,
I,D., Basuki, T., 2003, Selected Indonesian Medicinal Plants: Monograph and
Descriptions Vol.1, 117-153, Grasindo, Jakarta.
Kulyal, P., Tiwari, U.K., Shukla, A.,
Gaur,A,K., 2010, Chemical Constituent isolated from Andrographis paniculata, Indian
Journal of Chemistry, Vol. 49B, hal 356-359.
Maiti, P.C., Kanji, S.K., Chatterje.,
1959. Studies in Kalmegh Extract, Indian
Journal of Pharmacy, 21:169-171
Mamatha, A., 2011. Quantitative KLTKT
Analysis of Andrografolid in Andrographis
paniculata Obtained from Different Geographcal Sources (India), International Journal of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences, 3(2): 42-44
Miller, J.C. and
Miller, J.N., 1988, 108-112, Statistics
for Analytical Chemistry, 2nd Edition.
Muhidin, S.A dan Abdurahman, M., 2007, Analisis Korelasi, Regresi and Jalur dalam
89-130, Penelitian, Pustaka Setia
Bandung
Nash., R, and Wachter, A., 2003, Pharmaceutical Process Validation, page
109-120, Marcel Dekker, New York
Qiang, Z.Z., 2007, Reactions and
Computational Studies of Andrografolid Anagoues with Glutathione and Biological
Nucleophiles, Desertation, City University
of Hong Kong
Saxena S, Jain DC, Gupta MM, Bhakuni
RS, Hari O. 1998 . Analysis of diterpenoid
andrografolid from Andrografolid peniculata. J liq chromatogr;
27-123.
Sharma, A., lal, K., handa, S.S., 1992.
Standardization of The Indian Crude Drug Kalmegh by High Pressure Liquid Chromatographic
Determination of Andrografolid. Phytochemical Analysis, 3:129-131
Sherma, J and
Fried,B., 2003, Handbook of Thin-Layer Chromatography 3ed, Revised &
Expanded, 226-234, Marcel Dekker, New York
Srivasta, A., Misra, H., Verma, R.K.,
Gupta, M.M., 2004. Chemical finger printing of Andrographis paniculata using HPLC,
KLTKT and Densitometry., Phytochemical Analysis, 15: 280-285
Subramanian, R., Azmawi,M,Z., Sadikun, A., 2008, In vitro a-glucosidase and a-amylase enzyme inhibitory effects of Andrographis paniculata extract and andrografolid, Acta Biochimica Polonia, Vol.55, 2, hal 391-398.